免疫组化仪操作规程

一、操作前准备

（一）设备检查

1. 外观检查：查看免疫组化仪的外壳是否有损坏、变形，各部件连接是否稳固。检查仪器的显示屏、操作按键是否正常工作，指示灯显示是否正常。
2. 试剂检查：确认所需的各种免疫组化试剂，如抗体、显色剂、缓冲液等是否齐全，检查试剂的有效期和保存条件是否符合要求。试剂应无变质、变色、沉淀等异常现象。
3. 耗材准备：准备好适配的载玻片、盖玻片、孵育盒、移液器吸头等耗材，确保其清洁、无杂质。
4. 仪器运行检查：接通电源，打开仪器开关，检查仪器的自检程序是否正常通过。查看仪器的温度控制、液体加样系统、振荡功能等是否能正常运行。

（二）样本准备

1. 组织切片：确保待检测的组织切片已制备完成，切片厚度一般在 4 - 6μm 之间，要求切片完整、无皱折、无刀痕，并且已牢固地附着在载玻片上。
2. 脱蜡水化：将组织切片进行脱蜡处理，一般依次经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡各 5 - 10 分钟，然后经过梯度酒精水化（无水乙醇 5 分钟、95%乙醇 3 分钟、85%乙醇 3 分钟、75%乙醇 3 分钟、蒸馏水冲洗 2 次）。

二、操作步骤

（一）预处理

1. 将水化后的组织切片放入免疫组化仪的孵育架上，确保切片位置摆放整齐，便于后续操作。
2. 根据实验要求，对组织切片进行抗原修复。常用的抗原修复方法有高温高压法、微波法等。在免疫组化仪中选择合适的抗原修复程序，设置修复温度、时间等参数（例如高温高压修复一般温度为 120 - 130℃，时间 1 - 3 分钟；微波修复一般功率 600 - 800W，时间 5 - 10 分钟），启动抗原修复程序。修复完成后，让切片自然冷却至室温。

（二）封闭与抗体孵育

1. 封闭内源性过氧化物酶（如果使用的是辣根过氧化物酶标记的检测系统）：在切片上滴加适量的过氧化物酶阻断剂，室温孵育 10 - 15 分钟，以消除内源性过氧化物酶的干扰。孵育结束后，用 PBS 缓冲液冲洗切片 3 次，每次 3 - 5 分钟。
2. 血清封闭：在切片上滴加适量的正常血清封闭液，室温孵育 20 - 30 分钟，以减少非特异性抗体结合。孵育后，倾去封闭液，无需冲洗。
3. 一抗孵育：根据实验设计，在切片上滴加适量稀释好的一抗工作液，将孵育架放入免疫组化仪中，设置孵育温度（一般为 4℃冰箱过夜孵育或 37℃孵育 1 - 2 小时，具体根据抗体说明书）和时间，启动孵育程序。孵育完成后，用 PBS 缓冲液冲洗切片 3 次，每次 3 - 5 分钟。

（三）二抗孵育

在切片上滴加适量与一抗匹配的二抗工作液，二抗一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。将孵育架再次放入免疫组化仪中，设置合适的孵育温度（通常为室温）和时间（一般 30 - 60 分钟），启动孵育程序。孵育结束后，用 PBS 缓冲液冲洗切片 3 次，每次 3 - 5 分钟。

（四）显色

1. 根据检测系统选择合适的显色剂。如果使用的是辣根过氧化物酶标记的二抗，常用的显色剂为 DAB（二氨基联苯胺）。在切片上滴加适量的 DAB 显色液，在免疫组化仪中室温显色 3 - 10 分钟（具体时间需根据显色情况在显微镜下观察调整，以出现清晰的棕色反应产物为宜）。
2. 显色完成后，用蒸馏水冲洗切片，终止显色反应。

（五）复染与封片

1. 苏木精复染：在切片上滴加适量的苏木精染液，室温复染 3 - 5 分钟，使细胞核染成蓝色，以显示细胞结构。复染后，用自来水冲洗切片 10 - 15 分钟，进行蓝化。
2. 脱水透明：将切片依次经过梯度酒精脱水（75%乙醇 3 分钟、85%乙醇 3 分钟、95%乙醇 5 分钟、无水乙醇Ⅰ5 分钟、无水乙醇Ⅱ5 分钟），然后经过二甲苯透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各 5 分钟）。
3. 封片：在切片上滴加适量的封片剂，盖上盖玻片，注意避免产生气泡。封片后，将切片从免疫组化仪中取出，待封片剂干燥后即可进行显微镜观察。

三、操作后处理

（一）仪器清理

1. 取出孵育架，清理仪器内部残留的液体和杂物。用干净的湿布擦拭仪器内部的孵育腔、加样针等部件，保持仪器清洁。
2. 倒掉仪器中的废液瓶中的液体，清洗废液瓶并晾干备用。
3. 检查仪器的液体管道，如有必要，按照仪器说明书进行冲洗和维护，防止管道堵塞。

（二）试剂处理

将剩余的试剂妥善保存，按照试剂的保存条件放回相应的储存位置。对于已开封的试剂，记录开封日期和使用情况，以便后续使用。

（三）样本保存

将完成免疫组化检测的切片妥善保存，可标记好样本信息后放入切片盒中，以备复查或进一步分析。

四、注意事项

1. 严格按照仪器说明书和试剂说明书进行操作，不同品牌和型号的免疫组化仪以及各种试剂在使用方法和参数设置上可能存在差异。
2. 实验过程中要注意避免交叉污染，使用的移液器吸头、容器等应及时更换，防止不同样本或试剂之间的相互污染。
3. 抗体的稀释度和孵育时间、温度等条件对实验结果影响较大，应根据抗体说明书和预实验结果进行优化。
4. 显色过程中要密切观察显色情况，避免显色过度或不足，影响结果判断。
5. 免疫组化仪应定期进行维护和校准，确保仪器的各项性能指标正常，以保证实验结果的准确性和重复性。
6. 操作过程中要注意个人防护，避免接触有毒有害的试剂，如二甲苯、DAB 等。如果不慎接触，应立即用大量清水冲洗，并根据情况进行相应的处理。